規(guī)格：100 管/96 樣
H2S含量測定試劑盒說明書
微量法
注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
H2S是一種新型氣態(tài)信號分子，存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，生理濃度的 H2S對神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長時程增強(qiáng)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用，并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應(yīng)。
測定原理：
H2S與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍(lán)，亞甲基藍(lán)在665nm 處有最大吸收峰，通過測定其吸光值可計算 H2S含量。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 8mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 8mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體 8mL×1 瓶，4℃保存。
試劑五：液體 1.5mL×1 管，4℃避光保存。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500 萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。
3. 血清（漿）：直接測定。
操作表：
1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至665nm。
2、 操作表
| 空白管 | 測定管 |
樣品（μL） |
| 75 |
H2O（μL） | 75 |
|
試劑一（μL） | 75 | 75 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑二（μL） | 75 | 75 |
10000g，4℃，離心 10min，去上清，留沉淀 | ||
H2O（μL） | 150 | 150 |
10000g，4℃，離心 10min，去上清，留沉淀 | ||
試劑一（μL） | 75 | 75 |
試劑三（μL） | 75 | 75 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑四（μL） | 75 | 75 |
12000rpm，4℃，離心 10min，取上清 | ||
試劑五（μL） | 15 | 15 |
混勻，25℃靜置20min，于微量石英比色皿/96孔板中，空白管調(diào)零，測定665nm吸光值，記為 A665。
H2S含量計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0044x，R2=0.9988
（1）組織樣品
a.按照蛋白濃度計算
H2S（μmol/mg prot）=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10-3 =0.727×A665 ÷Cpr
b.按照樣本重量計算
H2S（μmol/g）=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10-3 = 0.727×A665 ÷W
(3) 細(xì)胞
H2S（μmol/104 cell）=A665÷0.0044×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量(萬個)）×10 -3
=0.727×A 665 ÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）
（2）液體樣品 H2S（μmol/L）=A665÷0.0044×V 反總÷V 樣= 727×A665
V 反總：反應(yīng)總體積，0.24mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.075mL；V 樣總：加入提取液體積，
1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
b.用 96 孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0022x，R2=0.9988
（1）組織樣品
a.按照蛋白濃度計算
H2S（μmol/mg prot）=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10-3 =1.454 ×A665 ÷Cpr
b.按照樣本重量計算
H2S（μmol/g）=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10-3 = 1.454×A665 ÷W
(3) 細(xì)胞
H2S（μmol/104cell ）=A665÷0.0044×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量(萬個)）×10-3
=1.454×A665 ÷細(xì)胞數(shù)量（萬個）
（2）液體樣品 H2S（μmol/L）=A665÷0.0044×V 反總÷V 樣= 1454×A665
V 反總：反應(yīng)總體積，0.24mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0.075mL；V 樣總：加入提取液體積，
1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
注意事項
z低檢出限為8μmol/L。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：
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| 染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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